两种遗传性溶血性贫血的致病基因结构和功能分析

【摘要】贫血是人类最常见的疾病之一,是指外周血中单位体积内血红蛋白的浓度、红细胞计数或者红细胞压积(HCT)低于相同年龄、性别和地区的正常标准,一般认为在平原地区,成年男性的血红蛋白<120g/L,红细胞<4.5×1012/L及(或)血细胞比容<42%,成年女性血红蛋白<110gL,红细胞<4.0×1012/L及(或)血细胞比容<37%可以诊断为贫血。遗传性溶血性贫血是一组由遗传因素引起的红细胞细胞膜、代谢相关的酶及血红蛋白异常,导致红细胞寿命缩短的异质性疾病；这一组疾病中受累的红细胞变得很脆弱,红细胞变形能力减低,细胞畸变,更容易受到剪切应力和氧化损伤,溶血过度时骨髓代偿造血,当骨髓造血功能代偿不足以满足机体的生理需求时即会发生贫血。受累或畸变的红细胞在血液循环中提前破坏或凋亡产生溶血,当大量红细胞被提前破坏,将导致造血组织内新生红细胞代偿性增殖,甚至重新开启髓外造血器官的造血功能,红细胞崩解后其代谢产物在体内聚集,给机体器官带来极大的危害,溶血性贫血疾病具有相同的血液学特征。地中海贫血和先天性红细胞生成异常性贫血是两种典型的遗传性贫血,地中海贫血分布广,危害大,先天性红细胞生成异常性贫血病情复杂,难以治疗,本文将通过几个家系阐述两种疾病其临床表型、分子基础及发病机制。第一部分一种新的HBA融合基因与东南亚型缺失(—SEA)共同导致HbH病的研究背景与目的地中海贫血(简称“地贫”)是世界上最常见、危害极大的常染色体隐性遗传病之一,广泛分布于全球热带和亚热带等疟疾高发地区,其中以α-地贫最为常见。α-地贫的分子遗传基础是位于人体第16号染色体短臂16p13.3位点上的α-珠蛋白基因(HBAl和HBA2)的先天性遗传缺陷,导致红细胞内13-珠蛋白相对过剩,游离的p-珠蛋白之间易形成不稳定p四聚体(异常血红蛋白H),β四聚体在红细胞膜上沉积,损伤红细胞,并带来一系列临床症状。HbH病属于中间型α-地贫,主要流行于东南亚各国及我国华南地区；我国最常见的三种α-地贫的突变为东南亚型缺失(——SEA)、-α3.7和-α4.2。其中HbH病主要由于东南亚型缺失(——SEA)与-α3.7或-α4.2,或与非缺失型突变如HbConstantSpring组合而成。α-珠蛋白基因簇是由多个高度同源的基因组成的多基因家族。不仅两个α-珠蛋白基因(α1和a2)同源性很高(分别由三个同源盒X,Y和Zbox组成,α-珠蛋白与其他基因同源也很高,α-珠蛋白与ψα1基因的同源性为73%。众所周知,同源序列之间容易发生同源重组,在α-珠蛋白基因簇中,-α4.2和-α3.7分别是由于正常α-珠蛋白基因簇在同源区Z和Xbox发生同源重组而产生。最近,有研究发现了α1和α2的融合基因α121和α212,这种融合基因产生机制可能是由正常α-珠蛋白等位基因与-α3.7或αααanti37基因再次发生交换产生的。本研究发现一种新的α-珠蛋白融合基因,本文拟通过家系研究对这一罕见α-珠蛋白基因变异进行分析,研究其对α-珠蛋白基因表达及对患者表型的影响,并根据α-珠蛋白基因的特征分析其发生机制。材料和方法1、研究对象：先证者表现为典型的小细胞低色素贫血,临床诊断为HbH病,贫血程度为中度,先证者每两个月接受一次输血治疗,血红蛋白维持在100g/L左右。4岁的时候,先证者被推荐给我们进行基因检测。在征得患者父母的同意,我们收集了先证者及其父母外周血标本进行此次研究。2、血液学指标分析方法：采集到患者及其家庭成员的外周血后,首先采用全自动血细胞计数仪对红细胞参数(血常规)进行检测,其次用高效液相色谱技术分析外周血红细胞内血红蛋白组分HbA、HbA2和HbF等。3、分子诊断方法：首先经采用经典酚/氯仿方法提取外周血白细胞基因组DNA。之后用常规的缺口PCR技术和反向点杂交技术对中国人常见的地贫突变进行分析。α-及p-珠蛋白基因罕见突变用Sanger测序检测,对于罕见或未知的α-珠蛋白基因拷贝数的变异则采用多重连接依赖探针扩增技术进行检测。根据以上分子检测技术初步确定变异的位置,设计跨越变异的引物将变异区域及其侧翼序列扩增,并通过Sanger测序来确定变异位点的特定序列,随后设计的特异性引物筛查人群中此变异的携带率。此变异改变了珠蛋白基因的转录本,据此设计特异引物以验证特异转录本的存在,从而验证了融合基因的结构及功能。结果和讨论血液学分析表明,先证者表现为中度小细胞低色素类贫血,血常规Hb86g/L,MCV69fL,MCH20.1pg,血红蛋白组分分析结果为：HbF1.2%,HbA21.8%,HbH11%,肝功能检测血浆总胆红素14.2μmol/L(正常范围：6-20μmol/L),无黄疸,肝脾大小正常,先证者长期精神不佳,面色苍白,临床表型符合HbH病的诊断,贫血程度为中度。同样对先证者父母的进行血液学分析,提示父母均为地贫携带者。家系成员的缺口PCR技术分析结果为先证者及其母亲均携带东南亚缺失突变(–SEA/),其父为(-α4.2/)携带者,α1及α2全长测序未见罕见或新突变,患者分子检测结果与临床表型不符,进一步通过MLPA检测发现患者α2的3’末端有异常,经过测序发现该区域存在密集的碱基替换,这一现象与其父的α2的3’末端相同,在美国国家数据库(NCBI)上进行检索,以及查询珠蛋白基因服务网站(http://globin.cse.psu.edu/),均未发现此变异类型,说明此变异是世界首报的一种α-珠蛋白基因变异类型。随后我们通过测序获得此变异的特异序列并与正常序列和(-α4.2/)序列比对后发现,这一变异是α2与ψα1的融合基因,通过逆转录PCR对携带变异的个体进行分析,均发现了融合基因的特异转录本。通过特异的PCR引物我们在500例样本中发现一例携带同样变异的案例。本研究发现了一种变异的α珠蛋白基因,丰富了地贫的基因类型,加深了对中国人群的地贫类型的认识,为分子诊断提供了必要的分子基础,同时还分析了这一融合基因的发生机制,为研究地贫基因的分子进化机制的研究提供了参考。第二部分由KLF1基因双重突变导致的一种新型红细胞生成异常性贫血的鉴定及功能分析背景与目的先天性红细胞生成异常性贫血(CongenitalDyserythropoieticAnemias,CDA)是一组具有遗传异质性和表型多样性的血液病。通常临床上根据红细胞的形态异常特征可将CDA分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和变异型。长期以来,人们对此病的认识只停留在临床表型层面,而对其分子机制缺乏认识,近十多年来的科学研究才逐渐揭开这种先天性血液病的神秘面纱。现在,对CDA的致病基因寻找和发病机制研究是本领域研究的热点。目前CDAⅠ、Ⅱ和Ⅲ型的致病基因已被鉴定出,其发病机制仍在研究中。变异型CDA的异质性表现在其临床表型与前三型均不同,目前尚缺乏对变异型CDA系统的认识,因此对CDA表型的系统描述、鉴定CDA致病基因及发病机制是很有必要的。最近研究发现一种变异型CDA,并鉴定出其致病基因为KLF1。研究表明KLF1的显性突变(E325K)导致了此病的发生。该基因表达产物很早就作为一种红系特异转录因子被发现,研究表明人群中KLF1基因的存在自然突变。通过敲除KLF1的小鼠实验证明KLF1显然是红细胞生成必不可少的细胞因子,然而人群中发现的诸多KLF1突变中仅E325K一种突变导致人体的疾病表型,其余突变类型只与红细胞内的良性表型相关。KLF1突变与疾病的关系有待进一步的研究。本课题研究源于我们课题组在遗传性贫血的研究工作中发现的两个先天性贫血的患者,我们发现这两个各患者有一些与地贫不相关的特殊表型。本文旨在找出该病的致病基因及变异,及基因的突变对蛋白的合成及功能的影响,并系统分析此疾病的临床表型特征,进一步提出与其他表型类似的遗传性贫血的鉴别诊断。材料和方法1、研究对象：两名病例为先天性贫血,贫血原因不明,被介绍到本实验室进行基因检测。在征得先证者父母及其他亲属的同意,我们收集了先证者的外周血和骨髓标本,并收集了家系中其他成员的外周血标本进行此次研究。2、临床表型分析：采集到患者及其家庭成员的外周血后,首先采用全自动血细胞计数仪、酶联免疫吸附技术及流式细胞术等方法获得红细胞参数、血液生化指标及红细胞表面蛋白表达水平,用透射电子显微镜观察红细胞的形态特征；其次用高效液相色谱技术分析外周血红细胞内血红蛋白组分HbA、HbA2和HbF的水平,随后进一步通过反相高效液相色谱技术对β、α等珠蛋白链进行检测。3、分子诊断方法：采用经典酚/氯仿方法提取外周血白细胞基因组DNA；之后用常规的PCR技术和Sanger测序检测常见地贫基因突变,对于罕见或未知的α和β-珠蛋白基因拷贝数的变异则采用多重连接依赖式探针扩增技术进行检测,用二代测序技术对红细胞发育相关的基因进行测序分析,通过以上生物技术手段完成致病基因的定位和突变鉴定,随后用Sanger测序进行验证。3、功能分析方法：构建致病基因带有GFP标签的KLF1表达载体,以HEK-293和K-562为细胞模型,通过体外观察转染后的细胞来分析致病基因的细胞定位,通过RT-PCR和免疫印迹来检测野生型和突变型KLF1的表达差异；构建KLF1调控通路中的下游基因p珠蛋白、BCL11A及CD44基因启动子的报告载体,通过共转染表达载体和报告载体来分析该基因对通路中的基因表达的调控功能。结果和讨论临床表现分析结果均提示先证者为溶血性贫血,具有小细胞低色素症和血红蛋白组分的变化,HbF表达显著升高,HbA2轻度升高,这些表型与中间型β-地贫极为相似,此外还发现红细胞CD44表达下降,以及InLu稀有血型等特征性改变,通过多种分子诊断方法均未发现地贫致病基因HBA、HBB及HBG等的变异。通过对红细胞超微结构的观察,发现中晚幼红细胞内铁沉积于线粒体内,核染色质致密度增加,核膜不完整,细胞膜出现大空泡样变化,提示红细胞发育异常,初步诊断为一种CDA的变异型。随后通过对一系列红细胞发育相关基因的深度测序,我们发现KLF1基因的双重突变可能导致这一疾病的发生。我们构建了KLF1正常和突变的表达载体,通过转染体外细胞实验来分析KLF1不同基因型的表达水平与正常对照组是否有差异,Levene检验不同组的方差齐性,按α=0.10的水准,F=9.21,p=0.006,认为各组不满足方差齐性,通过Welch方法比较KLF1突变组与正常KLF1的mRNA相对表达水平,F’=3.83,p=0.02,认为不同组的总体均数不全相等,采用DunnettT3检验进行多重比较,按a=0.05的水准,Wt组与其余3组之间均无统计学意义(p<0.05),认为各突变组(A298P、G176RfsX179、P338S)与正常对照组(wt)表达水平无差异,因此认为KLF1不同基因型的转录水平无差别。为了研究KLF1不同基因型对下游基因的调控作用,本研究构建KLF1作为表达的载体和下游基因(HBB、BCL11A、CD44)启动子的报告载体,通过荧光素酶报告系统来分析KLF1对下游基因启动子的调控作用。我们通过共转染KLF1不同基因型的表达载体与HBB启动子的报告载体,收集不同组的相对荧光值,Levene检验不同组的方差齐性,按α=0.10的水准,F=4.22,p=0.004,认为各组不满足方差齐性,通过Welch方法比较KLF1突变组与正常KLF1对HBB启动子的效应,F’=7.81,p<0.001,认为不同组的总体均数不全相等,采用DunnettT3检验进行多重比较,按α=0.05的水准,p<0.001,认为正常对照组与纯合突变组(A298P/A298P、G176RfsX179/G176RfsX179P338S/P338S)及双重杂合突变组(A298P/G176RfsX179、P338S/G176RfsX179和A298P/P338S)有统计学意义,说明对于HBB基因来说,以上KLF1三种突变不具有单倍型不足的现象,而KLF1的两个等位基因发生变异导致了HBB表达降低。我们通过共转染KLF1的表达载体与BCL11A启动子的报告载体,收集不同组的相对荧光值,Levene检验不同组的方差齐性,按a=0.10的水准,F=1.46,p=0.228,还不能认为各组不满足方差齐性,通过统计学方法One-wayANOVA分析KLF1突变组与正常KLF1对BCL11A启动子的效应,F=17.06,p<0.001,认为不同组的总体均数不全相等,采用Bonferroni检验进行多重比较,按α=0.05的水准,p<0.001,认为正常对照组与纯合突变组(A298P/A298P,G176RfsX179/G176RfsX179和P338S/P338S)及双重杂合突变组(A298P/G176RfsX179、P338S/G176RfsX179和A298P/P338S)有统计学意义,说明对于BCL11A基因来说,以上KLF1三种突变不具有单倍型不足的现象,而KLF1的两个等位基因同时发生变异导致了BCL11A表达降低,γ-珠蛋白基因抑制作用降低,因此表达上调。我们通过共转染KLF1的表达载体与CD44启动子的报告载体,收集不同组的相对荧光值,Levene检验不同组的方差齐性,按a=0.10的水准,F=9.21,p=0.006,还不能认为各组不满足方差齐性,通过统计学方法One-wayANOVA分析KLF1突变组与正常KLF1对CD44启动子的效应,F=74.65,p<0.001,认为不同组的总体均数不全相等,采用Bonferroni检验进行多重比较,按α=0.05的水准,p<0.001,认为正常对照组与纯合突变组(A298P/A298P、G176RfsX179/G176RfsX179和P338S/P338S)、双重杂合突变组(A298P/G176RfsX179、P338S/G176RfsX179和A298P/P338S)和杂合突变组(wt/A298P、wt/G176RfsX179和wt/P338S)均有统计学意义,说明对于CD44基因来说,以上KLF1三种突变具有单倍型不足的现象,KLFl杂合突变足以下调CD44的表达。本研究首次报道了一种新型CDA亚型,它是一种具有地贫样表型,并具有红细胞特征性改变的隐性遗传病,本研究丰富了KLFl基因的突变谱,有助于阐明KLF1在CDA发生中的病理学机制,为红细胞发育的研究提供新线索,还可为CDA的临床诊治提供科学依据。
【作者】黄际卫；
【导师】徐湘民；
【作者基本信息】南方医科大学，医学遗传学，2014，博士
【关键词】遗传性溶血性贫血；α-地中海贫血；HbH病；拷贝数变异；基因突变；融合基因异常转录本；先天性红细胞生成异常性贫血；KLFl基因；转录因子；转录调控；

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